Projekt: Funktion der Legionella pneumophila Phospholipasen beim Austritt aus der Vakuole und dem Wirt

  Hartmanella vermiformis Amöbe infiziert mit Legionella pneumophila Urheberrecht: © Flieger

Legionella pneumophila (Lpn) ist ein wichtiges intrazelluläres bakterielles Pathogen, das die Lunge des Menschen und Umweltprotozooen infiziert. Die Bakterien replizieren in einem besonderen Phagosom, das die Legionella-enthaltende Vakuole (LCV) genannt wird. Der Austritt von Lpn aus infizierten Wirtszellen kann zuerst die Freisetzung der Bakterien aus der LCV und folgend auch aus der Wirtszelle umfassen.

Der Exit aus dem infizierten Wirt stellt einen bedeutenden Schritt des Infektionszyklus dar, der dem Pathogen die weitere Transmission erlaubt. Diese ist essentiell für die Ausbreitung der Erkrankung oder die Verbreitung des Pathogens in der Umwelt. Aber die Mechanismen, die den Austritt der Bakterien aus dem Wirt herbeiführen sind zu einem großen Teil noch ungeklärt. Insbesondere bakterielle Phospholipasen können aufgrund ihrer membranzerstörenden Aktivität den Wirtszellaustritt von Lpn fördern. Lpn besitzt eine Vielzahl an Phospholipasen und die GDSL and PlaB Enzymgruppen sind aufgrund ihrer Substratspezifität und hohen Aktivität, ihrer Abundanz zu späteren Zeitpunkten des bakteriellen Wachstums, ihrem Einfluss auf die Virulenz, ihrer sekretierten oder oberflächenassoziierten Natur und Lokalisation bei der Wirtszellinfektion besonders geeignet den bakteriellen Exit zu unterstützen.

Im hier vorgestellten Projekt sollen 1) Methoden der Exit Quantifizierung, wie ein Betlaktamase-basierter oder ein metabolischer Reporter Assay, die die Freisetzung der Bakterien aus der LCV in das Zytosol kombiniert mit Fluoreszenz Readouterfassung detektieren, etabliert werden. 2) Außerdem soll die Bedeutung der Phospholipasen und deren hyperaktiven Proteinversionen für den Lpn Exit und bezüglich der Wechselwirkung mit LCV-schützenden Faktoren durch Exitanalysen von definierten Lpn Mutanten bestimmt werden. 3) Es soll untersucht werden wie die Lpn Phospholipasen den Austritt aus der LCV herbeiführen und welche Lipide kritisch für die beobachteten Phänotypen sind. Weiterhin sollen artifizielle Lipid-Bilayer Assays durchgeführt werden, um das enzymatische Potential der Phospholipasen hinsichtlich Membrandisintegration und einen möglichen Effekt von LCV-protektiven Faktoren zu analysieren. 4) Es soll ein Screen einer Lpn Transposon Insertionsbibliothek auf essentielle Exitgene unter Anwendung der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung durchgeführt werden. Schließlich werden dabei gefundene Mutanten hinsichtlich ihres Grades und der Qualität des Exitdefektes (Link Ziel 2), ihres Effektes auf die LCV Lipide (Link Ziel 3) und hinsichtlich ihres Verhaltens in unterschiedlichen Infektionsmodellen charakterisiert. Insgesamt sollen die im Projekt erhaltenen Erkenntnisse helfen, den Austrittsprozess von Lpn aus Wirtszellen besser zu verstehen.