Projekt: Das Ejektosom: Entschlüsselung des Proteoms

 

Obwohl die Übertragung von pathogenen Organismen von Zelle zu Zelle ebenso essenziell für die Aufrechterhaltung einer Infektion ist wie die Aufnahme und Replikation des Pathogens, ist nur wenig über die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bekannt.

Im Infektionssystem Dictyostelium - Mykobakterium marinum verlassen zytosolische Bakterien die Wirtszelle durch das Ejektosom, eine Struktur, die stark mit Aktin angereichert ist. Der Egress der Bakterien verläuft non-lytisch für die Wirtszelle und ist für eine effiziente Zell-zu-Zell-Übertragung der Bakterien essenziell. Bisher ist nur wenig über die Zusammensetzung und Funktionsweise des Ejektosoms bekannt.

Im vorliegenden Projekt wollen wir die Zusammensetzung des Ejektosoms auf Proteinebene entschlüsseln. Dazu verfolgen wir zwei Ansätze, eine auf räumliche Nähe basierende Markierungsmethode und eine Anreicherung von Ejektosomen. In beiden Fällen werden putative Interaktionspartner dann massenspektrometrisch aufgeschlüsselt werden. Bei dem ersten Ansatz werden wir Proteine von Wirt und Pathogen, die im Ejektosom angereichert sind, fusioniert mit APEX2 exprimieren. Proteine in naher Umgebung werden durch Biotinylierung markiert und können so anschließend angereichert und identifiziert werden. Im zweiten Ansatz werden Ejektosomen aus einem Dictyostelium-Stamm angereichert, bei dem aufgrund der Expression eines Aktin-bindenden Proteinfragments die Struktur häufiger auftritt und stabiler ist. Durch optimierte Lyse- und Anreicherungsschritte sollen dann Ejektosomen isoliert und anschließend ihre Proteinzusammensetzung massenspektroskopisch bestimmt werden.

Wir erwarten, dass die Entschlüsselung des Ejektosom-Proteoms Aufschluss darüber geben wird, welche Wirts- und Pathogenfaktoren an der Zell-zu-Zell-Übertragung der Bakterien beteiligt sind. Dies wiederum liefert uns Hinweise auf zu Grunde liegende molekulare Mechanismen. Wir erwarten, dass die daraus gewonnenen Erkenntnisse es erlauben werden, durch eine Modulation der Egress-Strategien die Verbreitung von Infektionen auf zellulärer Ebene einzuschränken. Dies würde einen weiteren und komplementären Ansatzpunkt in der Infektionsbekämpfung darstellen.